Специфічність визначають як міру впливу на результат аналізу речовин, відмінних від тих, що аналізуються. До них відновні групи речовин: 1) подібні з лігандом за своїми фізикохімічними властивостями і тому здатні безпосередньо взаємодіяти зі зв’язуючим агентом (перекресна реактивність) і 2) ті, що безпосредньо не реагують зі зв’язуючим реагентом, але здатні впливати на основну реакцію між і лігандом (кислотою).
При проведенні всіх реакцій з’єднання основна проблема представляє неспецифічна перекресна реактивність зв’язуючого реагенту. У разі використання антисироватки є 3 причини перехресної взаємодії:
1) одна і та ж гомогенна популяція антитіл може реагувати з багатьма родинними між собою лігандами, причому для шкірної такої реакції характерне своє значення константи спорідненості (К);
2) антисироватка може містити різні популяції молекул антитіл, одна або кілька з яких можуть бути специфічними щодо такої ж ділянки молекули антигену, який є також у родинних з’єднаннях;
3) антисироватка може містити антитіла, специфічні відносале до домішок, присутніх як у препараті ліганда, так і в матеріалі, що аналізується.
Оцінку величини перехресної реакції проводять за схемою, описаною в розділі контроль якості. Способи підвищення специфічності зв’язуючого реагенту залежати від його природи. Для природних зв’язуючих реагентів (білки крові або клітинні рецепторі) єдиним методом підвищення специфічності є проведення попередньої екстракції. При використанні антитіл можливостей для прямого підвищення специфічності значно більше. До них числа відноситься: вибір схеми імунізації, підбір розумів аналізу, а та шкір видалення небажаних популяцій молекул шляхом виснаження антисироватки.
Неспецифічність, пов’язану з присутністю в імуногені домішок, можна обійти при використанні чистого ліганду.
Неспецифічність, зумовлену присутністю однакових антигенних ділянок в імуногені та родинній йому речовині, можна виключити шляхом використання такого фрагмента імуногену, який не містить загальної антигенної ділянки.
Неспецифічність, зумовлену взаємодією однієї гомогенної популяції антитіл з деякими подібними антигенними ділянками, шляхом підбору імуногену виключити не можна.
Для видалення небажаної популяції антитіл застосовують метод виснаження. З цією метою використовують очищення препарат фрагменту, що містить загальну антигенну ділянку або препарат загрязнюючої речовини. Іноді комбінують обидва прийоми.
Існують два прийоми виснаження антисироватки: 1) перехресно реагуючу речовину додають в антисироватку і видаляють імунопреципітат, що утворився за допомогою центрифугування; 2) перехресно реагуючу речовину додають у розчинній формі, зв’язаний із твердою фазою (типу целюлози або сефадексу).
Специфічність тесту можна підвищити також шляхом підбору умов проведення аналізу, наприклад:
1) при дуже сильному розведенні антисироватки неспеціфічність, зумовлена присутністю антитіл, які володіють низькою спорідненістю, може бути незначною;
2) використовувати високоочищений мічений ліганд;
3) проводити найбільш вибіркове розділення зв’язаної та вільної фракцій.
Неспецифічність іншого типу зумовлена присутністю речовин, що перешкоджають взаємодії між зв’язуючим реагентом та лігандом: сильно заряджені речовини типу гепарину, високі концентрації солей, сечовини, кислот та лугів. Така неспецифічність виявляється в тому, що при радіотестуванні невідомої проби концентрація ліганда виявляється вищою за концентрацію, виміряну за допомогою інших незалежних методів аналізу.
У деяких випадках неспецифічні ефекти можуть наводити до занижених значень концентрації. В основі даної неспецифічності лежать 4 механізми:
1) блокада взаємодії зв’язуючого реагенту з лігандом;
2) розкид величин NSB;
3) руйнування або інактивація зв’язуючого реагенту або міченого ліганду;
4) руйнування чи інактивація неміченого ліганду.
До практичних способів усунення неспецифічності 2-го типу відноситься:
1) забезпечення ідентичності загального складу стандарту проби, що аналізується (наприклад, за вмістом білка);
2) визначення ступеня адсорбції міченого або неміченого ліганда з розчину, що аналізується на стінках пробірки (у пробірку додають мічений ліганд, потім його витягують і визначають радіоактивність, що залишилася);
3) усунення можливості ферментативного розщеплення (у інкубаційну среду додають інгібітори ферментів);
4) екстракція та концентрування ліганду.